El trabajo evangelizador de los misioneros en los primeros años de la Nueva España estuvo enfocado en combatir el paganismo en sus centros más importantes de adoración y gobierno, este fue el caso de Tlaxcala y de su asentamiento actual, debido a que era un importante centro de culto y política con uno o varios teocalis (Ricard 2017: 237).

En la zona donde se desplanta la basílica se encontraba originalmente una iglesia advocada a San Lorenzo, construida por orden de fray Toribio de Benavente (Motolinía) entre 1536 a 1539 con materiales obtenidos de un adoratorio prehispánico desmantelado por órdenes de fray Martín de Valencia (Rodríguez 2007: 199-200).

La conformación del culto de Ocotlán se originó en el año de 1541, al final del episcopado de fray Julián Garcés (Ricard 2017: 269), según cuenta la tradición:
“El día, y año, en que esto sucedió, no se sabe; pero nos consta, que fue a tiempo, que las destrozadas vidas de tantos miserables difuntos, clamaban al Cielo […], llegaron estas lastimas a los oídos de la Madre de la Clemencia, y se le puso improvisamente delante al afligido Juan Diego, que iba no sé, si subiendo, o bajando la loma, que hoy decimos de Ocotlán […]. Abrió la Señora sus dulcísimos labios, […], lo saludó de esta suerte: Dios te Salve Hijo mío” (Loayzaga 1750: 21-22).

Después de esta primera aparición, según la leyenda, la Virgen solicitó a Juan Diego Bernardino que comunicara a los frailes que debían buscar su imagen en el interior de un árbol, para posteriormente ser trasladada al templo de San Lorenzo (Loayzaga 1750: 28-29) (Rodríguez 2007: 198). Desde el siglo XVI comenzaron las peregrinaciones al templo debido a un milagro ocurrido en ese lugar (Rodríguez 2007: 199).

Para el año de 1687, la iglesia de San Lorenzo, en palabras del padre Juan de Escobar, primer capellán de la basílica: “pequeña concha, para tan gran perla” (Loayzaga 1750: 38), ya que “le pareció que la Virgen merecía una iglesia suntuosa para su culto, pues la capilla de san Lorenzo, […], era una construcción muy sencilla” (Baños 1994: 76), por lo que comenzó la construcción de un nuevo santuario, en el mismo lugar donde se encontraba la imagen, con materiales y mano de obra de los indígenas de la zonas cercanas (Loayzaga 1750: 38, 40) (Rodríguez 2007: 199-200).

Juan de Escobar fue capellán del santuario hasta 1691, cuando dejo el lugar a manos de Francisco Fernández, quien estuvo a cargo hasta el año de 1717; con él al frente, se colocó el segundo retablo, dedicado a la Virgen de Guadalupe (Rodríguez 2007: 200).

El tercer capellán, Manuel Loaizaga, fue quien ordenó la construcción de una gran parte de la basílica, ya que durante su gestión se iniciaron las obras del camarín, la sacristía, la antesacristía, el claustro de la casa, el retablo del ábside y de los cruceros (Rodríguez 2007: 200), estos últimos auspiciados por el Lic. Luis Valadés (Baños 1994: 77), entre otros elementos internos realizados por el orfebre Antonio Fernández (Rodríguez 2007: 200).

Loaizaga también fue el escritor de la “Historia de la Milagrosísima Imagen de Nuestra Señora de Ocotlán”, escrito en el año de 1747, donde recapituló los acontecimientos más importantes del culto de la Virgen así como de su santuario. Uno de los pasajes nos describe el interior del camarín en aquellos años, realizado por el artífice Francisco Miguel Tlayotle Huamaintzín:
“La figura del Camarín es un perfecto ochavo, que sube a proporción del Templo, y a sus mismas medidas se extiende en semicírculo. Sobre él solo asientan ocho columnas, cada una en su repisa; y a toda la distancia, que lleva el arte. Entre columna, y columna corta un arco, muy parecido al Iris, por los colores, que sin sobresalir de la pared, ofrece liberal, a siete lienzos, que expresan la Vida, y Misterios de la Santísima Virgen, todo el buque, que es necesario. Siete, dije: porque el octavo, es verdaderamente la octava maravilla; y el que respalda a la Señora; según se verá a su tiempo. Desde las cornisas rompe hacia lo alto la bóveda, dejando ya rota sobre cada lienzo, una ventana muy capaz, por donde el Sol entra, y sale, casi a todas horas del día, a dar mejor oriente, y más glorioso ocaso a su luz. La clave, o cúpula de esta admirable machina, es todo el Cielo abreviado; porque la corona una Efigie a medio relieve, de la gran Reyna, a quien sirve de majestuoso recinto, la gloriosa turba de los Apóstoles. A todo esto da el ser una Paloma, que figura al Espíritu Santo; tan viva, y tan natural, que parece, que con las plumas está avivando las llamas, o las lenguas de fuego, que desprende del pico. Las columnas mantienen sobre sus cabezas ocho Ángeles (cuyo primor, o garbo, no cifro; porque no ay pincel para el aire) de talla todos, y todos en las manos, con las insignias, o atributos, qué expresan la Concepción en gracia de la Purísima Madre” (Loayzaga 1750: 50).

Para el periodo de 1758 a 1767, la basílica estuvo a cargo de Manuel Ponce de León, quien inició las obras de la nave del templo (Rodríguez 2007: 200) y que junto a los siguientes tres capellanes: José Belendez (1761-1783), Juan Antonio Miranda (1784-1786) y Antonio Pineda (1787-1790), en palabras de Rosa Aurora Baños López (1994: 77) “acabaron de perfeccionar la obra de sus antecesores: a ellos se les atribuyen los actuales retablos, la portada y las torres”. Los murales, realizados en 1764, son obra de Juan de Villalobos.

El estilo arquitectónico que presenta la basílica es churrigueresco, caracterizado por ser muy ornamental, tanto en exteriores como en interiores, esto responde a un estado social de estabilidad y prosperidad que vivió la Nueva España durante los años de la construcción del santuario (Toussaint 1974: 147).

La basílica de Ocotlán fue declarada como monumento histórico el 3 de enero de 1936, en esta se menciona a la capilla de San Lorenzo (Vázquez 1981: 106).

El historiador Manuel Toussaint (1974: 156) describe al santuario con una técnica perfecta ya que menciona que los estípites no han sido tallados en piedra si no que fueron elaborados a mano, también menciona a las torres que flanquean la portada y por último nos menciona brevemente el interior de la basílica.

El santuario fue incluido dentro de la declaratoria de zona de monumentos históricos de la ciudad de Tlaxcala de Xicoténcatl (de la Madrid 1986: 22).